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如何阅读基因载体图谱
  • 发布日期:2018-11-12      浏览次数:602
    •   基因载体是基因工程的核心,也是基因治疗中强有力的生物工具,我们先来认识和阅读载体图谱吧。

        载体分类及载体组成元件

        载体分类

        1、按属性分类:病毒载体和非病毒载体

        病毒载体是一种常见的分子生物学工具,可将遗传物质带入细胞,原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞,进行感染的分子机制。可发生于完整活体或是细胞培养中。可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件:

        (1)携带外源基因并能包装成病毒颗粒;

        (2)介导外源基因的转移和表达;

        (3)对人体不致病;

        (4)在环境中不会引起增殖和传播。

        非病毒载体一般是指质粒DNA。

        2、按进入受体细胞的类型分类:原核载体、真核载体、穿梭载体(含原核和真核2个复制子,能在原核和真核细胞中复制,并可以在真核细胞中有效表达)。

        3、按功能分类:克隆载体、表达载体

        克隆载体:具有克隆载体的基本元件(Ori,Ampr,MCS等),可以携带DNA或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA(外源基因)的载体。

        表达载体:克隆载体中加入一些与表达调控(具有转录/翻译所必需的DNA顺序)有关的元件即成为表达载体。

        载体组成元件

        1、复制起始位点Ori:即控制复制起始的位点。Ori的箭头指复制方向,其他元件标注的箭头多指转录方向(正向)。

        2、抗生素抗性基因:可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+

        (1)Ampr:水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。

        (2)tetr :可以阻止四环素进入细胞。

        (3)camr:生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。

        (4)neor(kanr):氨基糖苷磷酸转移酶,使G418(卡那霉素衍生物)失活。

        (5)hygr:使潮霉素β失活。

        3、多克隆位点:MCS克隆携带外源基因片段,它具有多个限制酶的单一切点,便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。还要再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA。一般来说,外源DNA越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。

        4、P/E:启动子/增强子

        5、Terms:终止信号

        6、加poly(A)信号:可以起到稳定mRNA作用

        示例阅读载体:

        1.pENTER载体

        1)human ORF + pENTER载体

        2) CMV启动子,T7启动子

        3) ORF的C端融合了Flag和His tag

        4) 多克隆位点,常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常见的)

        4) SV40 poly(A)加尾信号

        5) SV40启动子启动的puro标记

        6) 2个腺病毒ITR序列和2个与腺病毒Ad5同源的序列,可用于将ORF序列同源重组到腺病毒载体,直接用于腺病毒的生产。

        2.慢病毒载体

        1)EF1a启动目的基因(可添加小标签FLAG或HIS等小标签)

        2)CMV启动GFP,非融合抗性筛选标记Puro(便于做细胞株的稳筛)

        3)WPRE(来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件),放置在目的基因的上游,能加强转基因的表达

        4) cPPT(来自HIV-1整合酶基因),增加慢病毒在宿主基因组的拷贝数,提高病毒滴度

        5)第三代慢病毒载体,载体中还包含HIV-1基因组中的顺式调节元件(ψ 包装 信号和LTR 长末端重复序列,其中3’LTR增强子功能缺失,5’LTR中U3区替代为CMV,更加安全的病毒载体)

        3.腺相关病毒载体

        AAV表达载体包括了中两个ITR + CMV(可替换其他组织特异性启动子,见改造载体部分)+ globin intron 内含子序列 + 目的基因 + poly A序列

        选择载体

        选择载体主要依据构建的目的,同时还要考虑载体中应有合适的限制酶切位点等。如果构建的目的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。选用哪种载体,还是要结合目的基因及载体特点以实验目的为准绳。

        载体选择主要考虑下述3点:

        1、构建DNA重组体的目的,克隆扩增/表达表达,选择合适的克隆载体/表达载体。

        2、载体的类型:

        (1)克隆载体的克隆能力—据克隆片段大小(大选大,小选小)。尤其对于病毒载体来说,载体包装容量的大小是评估能否成功包装病毒的首要因素。

        ①腺病毒可以插入长约8kb的外源基因。目前,我们包装过长度为7.5kb外源基因的腺病毒。

        ②慢病毒的包装容量约为6kb(包含载体带有的其他抗性基因或报告基因),但是2kb以上的外源基因包装慢病毒难度就增加了,增大1kb会下降1个单位数量级的滴度,故2kb以上的基因包装慢病毒需要进行评估。此外,毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白(作为受体、转运蛋白行使功能)等由于其本身的功能,包装可能会有一定难度。

        ③AAV的总包装容量是4.7 kb(包含载体中两个ITR约0.3kb +具体启动子 + 内含子约0.6kb + 具体荧光标签 + polyA约0.2kb),所以插入目的基因一般约2kb 左右。由于AAV包装容量有限,目的基因大于2kb,可考虑去除内含子,因为内含子只是有助于插入的目的基因稳定表达。

        (2)确定表达蛋白的目的,然后再来选择优势的表达质粒。一般分为原核表达和真核表达质粒,前者主要用于体外纯化蛋白,如带His-tag的PET系列,带GST-Tag的PGEX系列,选用不同的表达载体,就得建立相应的纯化系统,包括缓冲液的配置、珠子/柱子的选择等等,还得考虑目的蛋白的可溶性,一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些,如GST的。这种原核纯化的蛋白一般用来制备单一的、需要量大的蛋白。真核表达载体一般是细胞、体内表达等需要时所用,只需要将它放到细胞或体内细胞即可,唯yi考虑的是它的启动子的选择,常用都是cmv启动子的,表达效率较高,也有多种启动子经过改造的表达载体,一般用来表达需要调控表达时间及表达量的蛋白。

        3、载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于连接,不产生阅读框架错位。

        ①选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载体);

        ②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个;

        ③必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地;

        ④必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因。

        选择载体还需注意:

        无标签载体,起始/终止密码子都要添加!

        标签在N端的载体,终止密码子要添加!

        标签在C端的载体,起始密码子要添加!

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